INESPERADO CONTRATIEMPO PARA LAS TERAPIAS GÉNICAS BASADAS EN CRISPR

(Estructura cristalina deducida de la proteína Cas9 (en azul), alrededor de una molécula de ADN (en amarillo) y formando complejo con una molécula de ARN guía (en rojo). Crédito de la imágen: Bang Wong, Broad Institute of Harvard and MIT, Cambridge, MA, USA.)

Publicación de Lluis Montoliu (7 de enero del 2018)
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http://naukas.com/2018/01/07/inesperado-contratiempo-las-terapias-genicas-basadas-crispr/

La revolución biomédica desatada por las herramientas CRISPR de edición genética ha generado también una enorme expectativa frente a la previsible utilización de las mismas en estrategias innovadoras terapéuticas, en nuevas terapias génicas somáticas, esto es, en individuos nacidos, adultos, afectados por algún desorden congénito. Sin embargo, un artículo reciente del laboratorio de Matthew H. Porteus (Universidad de Stanford) acaba de detectar, en la sangre de personas, células del sistema inmune y anticuerpos específicos contra un componente esencial de las herramientas CRISPR, la proteína Cas9. Este contratiempo inesperado deberá tenerse muy en cuenta antes de saltar a la utilización efectiva de las herramientas RISPR en terapias génicas para pacientes de enfermedades congénitas.

Las herramientas CRISPR, que derivan de las bacterias y que fueron descubiertas por Francis Mojica, microbiólogo de la Universidad de Alicante, se han usado para editar genes a voluntad en múltiples organismos. Por ejemplo para incorporar alteraciones
genéticas específicas en animales de laboratorio, en ratones, y estudiar el efecto de las mismas mutaciones en los mismos genes tras el diagnóstico genético de los pacientes de alguna enfermedad con base genética. Son los llamados ratones avatar.

Obviamente, si es posible usar las herramientas CRISPR para incorporar mutaciones también pueden usarse para corregirlas. Desde principios de 2016 conocemos ya el éxito de múltiples experimentos pre-clínicos (en animales, no en personas) en los que usando ratones o ratas modelo de alguna enfermedad congénita y la administración de los componentes del sistema CRISPR de edición genética ha sido posible revertir las mutaciones en genes específicos en un porcentaje significativo de las células del órgano afectado.
Estos experimentos pioneros han suscitado, lógicamente, una extraordinaria esperanza entre los millones de pacientes afectados de alguna enfermedad congénita, para los cuales no hay ningún tratamiento actualmente disponible.

Las herramientas CRISPR se suelen representar como unas tijeras moleculares. El componente principal es la proteína Cas9, una enzima endonucleasa que corta un gen (ADN) determinado guiada por una pequeña molécula de ARN, de ahí que sean unas tijeras programables. Hace un par de meses pudimos observar imágenes microscópicas de la proteína Cas9 cortando específicamente un gen.
El corte específico en el ADN pone en marcha los sistemas de reparación de la célula que serán los encargados de generar una mutación en el lugar del corte o utilizar un ADN molde aportado para substituir y corregir la mutación pre-existente.
La proteína Cas9 es una molécula de gran tamaño (1368 aminoacidos), con múltiples dominios y funciones. Habitualmente se utilizan dos proteínas Cas9, derivadas de las bacterias patógenas Streptococcus pyogenes (SpCas9) o Staphylococcus aureus (SaCas9). Esta última (SaCas9) es más pequeña (1053 aminoácidos) y, por ello, es la preferida para aplicaciones terapéuticas, pues el gen que la codifica cabe en los vectores derivados de virus adeno-asociados (AAV) usados en terapia génica.
Ambas bacterias son muy comunes y están presentes, a veces sin necesidad de producir una infección, en muchas personas. S. pyogenes puede causar faringitis, otitis, mastitis y otras infecciones en la piel. S. aureus puede causar infecciones graves y aparece regularmente asociada como la causante de muchas infecciones nosocomiales (hospitalarias).

Sabíamos de la inmunogenicidad de la proteína Cas9, su capacidad para suscitar una respuesta del sistema inmunológico, como uno de los problemas a tener en cuenta para su uso en terapia. En concreto, si el tratamiento terapéutico requiere la administración repetida de Cas9 en pacientes puede producirse una reacción inmune a partir de la segunda exposición a Cas9 que comprometa su efectividad y ponga en peligro la vida del paciente a tratar. Pero lo que no sabíamos es que un número importante de personas
son portadoras ya en su sangre de anticuerpos y células del sistema inmune dirigidas contra la proteína Cas9. Este es el resultado inesperado que nos ofrece el estudio del laboratorio de Porteus.

Los resultados obtenidos por Porteus no dejan lugar a dudas. En el suero del 79% de las personas testadas lograron identificar la presencia de anticuerpos específicos anti SaCas9. Porcentaje que se reduce al 65% en el caso de SpCas9. Los anticuerpos son producidos por los linfocitos B y constituyen la denominada inmunidad humoral. En relación a las células del sistema inmune encargadas de la inmunidad celular (los linfocitos T) estos investigadores encuentran linfocitos T específicos anti-SaCas9 en la sangre circulante de 46% de los donantes testados.

Sin embargo, no son capaces de detectar linfocitos T anti-SpCas9, aunque argumentan que puede ser debido a la sensibilidad del método empleado y no pueden descartar que no los haya. Los números de donantes analizados no son muy altos: 22 donantes de sangre y 12 adultos sanos que aportaron sangre circulante, pero los resultados obtenidos son claros, y los porcentajes reportados podrían ser una aproximación al porcentaje real de inmunidad frente a Cas9 existente en la población en general, lo cual obliga a reconsiderar las próximas estrategias terapéuticas basadas en componentes CRISPR.

¿Cómo puede ser esto? Parece que nuestra habitual interacción, infecciosa o no, con estas bacterias patógenas ha hecho que nuestro sistema inmune haya tenido la oportunidad de estar expuesto a las proteínas de estos microorganismos, incluida por supuesto la endonucleasa Cas9 que nos ocupa, y, por ello, haya podido desarrollar en muchos casos una respuesta inmune contra ella.

Como dice Porteus en su artículo, la existencia de anticuerpos anti-Cas9 puede que no sea un problema tan grave, teniendo en cuenta que las estrategias terapéuticas actuales no exponen la Cas9 directamente al torrente sanguíneo, sino que trasladan el gen que codifica para Cas9 dentro de una cápside viral de AAV que vierte sus contenidos dentro de la célula diana, o la reparten conjugada con nanopartículas, no distribuida como una proteína aislada en el torrente sanguineo. Y, además, en los ensayos clínicos de terapia génica, si los pacientes tuvieran inmunidad frente alguno de los componentes administrado (como la Cas9 o las partículas virales AAV) serían excluidos del ensayo.

El problema principal parece ser la inmunidad celular, la existencia de linfocitos T anti-Cas9, de los dos tipos CD4+ (colaboradores) y CD8+ (supresores), por su potencial para generar una fuerte respuesta inflamatoria, con la producción asociada de citoquinas como IFN-gamma o TFN-alfa. La existencia de estas células T anti-Cas9 en la sangre de personas eliminaría cualquier célula que hubiera incorporado la proteína Cas9 (cualquier célula que habría sido editada genéticamente) debido a que fragmentos/péptidos derivados de la proteína Cas9 podrían presentarse al sistema inmune en la superficie de las células editadas
a través del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I.

Esto inactivaría de inmediato los beneficios esperados de la estrategia de terapia génica. Además, esto sería un problema particularmente grave en aquellas estrategias basadas en el uso de partículas virales AAV, que utilizan la expresión constante de construcciones génicas de Cas9, y que, más allá de transducir preferentemente las células seleccionadas, y debido a la falta de específidad absoluta de los serotipos AAV usados, acabarían también transduciendo otras células, como las del hígado, normalmente. La presentación de péptidos Cas9 a través de MHC clase I en la superficie de hepatocitos transducidos reactivaría los linfocitos T anti-Cas9 y desataría una respuesta inflamatoria sistémica de consecuencias imprevisibles, y nada beneficiosas para el paciente tratado. Esto obligaría al uso de estrategias de inmunosupresión o disminución de la respuesta del sistema inmune tras estos tratamientos, y comprometería la seguridad y la eficacia de los mismos.

Deberemos estar atentos a estudios posteriores que puedan confirmar estas observaciones en un número mayor de personas analizadas, pero está claro que estamos ante un inesperado contratiempo para las terapias génicas basadas en el sistema CRISPR (en la proteína Cas9) que habrá que tener muy en cuenta antes de lanzar su utilización terapéutica en posibles pacientes.

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